PFOS 致大鼠肝毒性及其作用机制研究
摘要: 通过全氟辛烷磺酸(perfluomoctane sultanate，PFOS)大鼠灌胃染毒实验评价 PFOS 对肝功能的影响， 探讨 PFOS 肝毒性反应的潜在机制与可能途径。
将 Sprague Dawley ( SD)雄性大鼠随机分为3组，分别以0mg·kg-1、5mg·kg-1和10mg·kg—1 PFOS灌胃染毒28d。以HE和油红染色法观察大鼠肝脏形态改变。ELISA 法测定各组谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT) 、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量变化。化学比色法测定肝匀浆脂代谢水平和氧化产物含量。RT-PCR 法检测肝脏内氧化应激以及脂代谢相关基因表达水平。
结果表明， PFOS 暴露大鼠体重显著降低而肝脏系数显著增加( P＜0.05) ，与对照组相比 PFOS 组血清肝功能酶均出现随 PFOS 浓度增加而升高( P＜0.05) 。同时大鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase，GSH-px) 和丙二醛( malondialdehyde，MDA) 水平在高剂量组显著升高( P＜0.05) ，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 含量先显著升高( P＜0.05) 后显著降低( P＜0.05) 。且肝脏中脂代谢水平也随 PFOS 浓度的增加而出现显著改变( P＜0.05) 。PFOS 组基因表达均较对照组显著上升( P＜0.05) 。
以上结果说明 PFOS 具有明显的肝毒性作用，可影响肝脂代谢水平，这可能与 PFOS 引起的氧化应激所导致的损伤有关。
关键词: PFOS; 雄性大鼠; 肝损伤;
全氟辛烷磺 酸 (perfluorooctane sulfonate，PFOS) 是全氟化合物的代表性化合物，具有良好的热及化学稳定性，自面世以来，被广泛应用于生产生活的诸多方面，如纺织、涂料、皮革、包装等。但同时以上稳定的性质也使PFOS进入环境后难以降解，并且能随环境介质的变化产生迁移和蓄积。
人或其他生物体则可通过呼吸、 饮食等因素间接或直接接触到 PFOS，研究发现 PFOS 在生物体中能长期停留，并发挥毒性效应。
目前已发现 PFOS 具有神经、生殖发育、 免疫等多重器官毒性， 其中又以肝脏毒性最为常见。作为主要的蓄积和效应器官，PFOS可引起肝细胞空泡出现，诱发肝肿大和肝细胞凋亡，同时导致肝糖脂代谢紊乱。有研究者提出这种干扰效果与PFOS对组成型雄甾烷受体( constitutive androstane receptor，CAR)、孕烷 X 受体( pregnane X receptor，PXR) 及肝 X 受体( liverX receptor， LXR) 等核受体的过度激活有关。但也有实验证实，部分基因敲除动物和转染细胞中以上PFOS 的诱导损害作用并未消失， 进一步研究也表明 PFOS 对以上核受体的活化作用在不同种属动物及脏器间具有差异，因此有研究提出 PFOS 可能存在其他的调控方式。
图：肝细胞空泡化
氧化应激已被证实与化学性肝损伤、 病毒性肝炎、 肝纤维化及肝癌等多种肝脏病变有关。近年来，有研究表明 PFOS 可以通过氧化应激影响肝的脂肪代谢，有学者认为这可能是由于 PFOS 激活了细胞的抗氧化机制，从而激活了调控脂肪生成的相关基因，最终导致肝脂肪累积，但是具体的机制还不确定。核转录因子 E2 相关因子 2( Nuclear factorE 2 related factor2， Nrf2) 作为细胞内一个重要的抗氧化信号分子，在保护细胞组织，对抗氧化损伤中有重要的作用。目前研究发现 Nrf2 在调节脂肪代谢过程中也扮演着重要的作用。Kitteringham 等［13］研究发现 Nrf2 敲除的成年小鼠肝脏内的脂质含量相对于野生型小鼠会有所降低。最近，也有研究报道了 PFOS 与 Nrf2 的关系。Shi 等［ 14］ 在研究中发现，斑马鱼胚胎可以通过激活 Nrf2 来对抗 PFOS 引起的氧化应激。Xu 等［ 15］ 发现 PFOS 可以通过 Nrf2 信号通路促进脂肪前体细胞的增殖分化。鉴于以上原因，我们拟通过动物实验考察PFOS 对大鼠肝脏毒效应表现及对氧化应激相关分子的影响， 借此探讨PFOS 肝毒性反应的潜在机制与可能途径，为 PFOS生态毒理学研究提供基础数据。
一、材料与方法( Materials and methods)
1.1 试剂与仪器
试剂:全氟辛烷磺酸(Assay LC-MS 98%，SigmaAldrich公司，美国); RT-PCR 试剂及引物(TaKaRa大连宝生物公司，中国);丙氨酸转氨酶试剂盒、谷草转氨酶试剂盒、碱性磷酸酶试剂盒(AppliedBiosystems公司，美国);丙二醛( MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(碧云天生物研究所，中国);甘油三酯(triglyceride， TG)、总胆固醇(totalcholesterol，TC) (南京建成生物工程研究所);二喹呆甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司);其他试剂均为国产分析纯。
仪器:5332型PCR仪(Eppendorf公司，德国)、MODEL550酶标仪(Bio-Rad公司，美国)、RM2126切片机(Leica公司，德国)、CK40显微镜(Olympus公司，日本)、CFI60数码相机(Nikon，日本) 。
1.2 试验动物及染毒
考虑到文献报道中 PFOS 对雄性大鼠具有较为明显的毒性效应，本次实验选用成年SD雄性大鼠30只，体重220～250g，上海西普尔必凯实验动物有限公司提供(SCXK沪2008-0016) ，实验室驯养1 周后随机分为0 mg·kg-1 PFOS(对照组)、5 mg·kg-1 PFOS(低剂量组)和10 mg·kg-1 PFOS( 高剂量组) ( n = 10)，灌胃染毒 28 d。期间每周称重并于实验结束颈椎脱臼处死动物，采集血清及肝脏样本进行相关指标检测。动物饲养室温18～23℃，相对湿度45%～55%。实验期间自由饮水摄食。
1.3 指标检测
1.3.1 脏器系数
大鼠处死前称重，处死后用预冷生理盐水漂洗肝脏，滤纸吸干称取肝重计算脏器系数: 脏器系数(%)=脏器重量(g)/大鼠体重(g)×100%。
1.3.2 肝脏病理观察
暴露结束后处死大鼠并取肝脏组织，制作冰冻切片进行油红染色，同时取肝组织用 10%中性福尔马林溶液固定，常规脱水后石蜡包埋制备4μm 切片，HE染色后显微镜观察其病理学变化。
1.3.3 肝功能指标测定
大鼠下腔静脉取血后室温3000r·min-1离心分离血清，ELISA试剂盒检测血清中谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶(AST) 碱性磷酸酶(ALP) 水平。
1.3.4 脂代谢和氧化还原水平的测定
处死大鼠后立即分离肝脏，精确称取100 mg肝组织，加入无水乙醇1 mL， 制成10%匀浆。BCA蛋白定量试剂盒测定上清液蛋白浓度，化学比色法测定肝匀浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平，硫代巴比妥酸( TBA) 法测定丙二醛( MDA) 含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)含量，谷胱甘肽氧化酶活力的测定方法(DTNB直接法) 测定谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 含量。
1.3.5 基因表达水平检测
大鼠处死后迅速剖腹摘取肝脏，称取 100mg 肝组织， Trizol抽提总RNA，紫外分光光度计测定OD260 /OD280 比值以检验纯度，两步法进行反转录和实时 PCR。反应体系为10μg·μL-1cDNA 模板2μL、10μmol·L-1引物各0. 4μL、2 ×SYBR 10μL、ddH2O 补充总体积为 20 μL。反应条件为 95 ℃、 5 s，退火温度 65 ℃、 30 s，72 ℃、 30 s，反应 40 个循环计算相对表达量。基因引物设计如表 1 所示。
1.4 统计学分析
实验数据用—x±s表示，用SPSS24.0统计软件分析数据。采用单因素方差分析，方差齐性用Least-significant difference进行检验，组间比较Student-Newman-Keuls法检验，P＜0.05表示有显著性差异。
二、结果( Results)
2.1 PFOS 暴露对大鼠一般状况的影响
染毒初期，大鼠活动在三组间无明显异常， 但随染毒时间延长，PFOS 组大鼠出现不同程度活动减缓、消瘦和毛发暗淡竖直，2 周后个别大鼠出现腹泻、脱毛和易怒现象，尤以10 mg·kg-1组大鼠更为典型。如表2、3 所示，实验第2周时，5 mg·kg-1暴露组大鼠体重与0mg·kg-1组相比即出现降低，但差异并不显著( P＞0.05) 。从第 18 天开始，10mg· kg-1暴露组大鼠体重显著降低，并呈现剂量反应关系(P＜0.05) 。肝脏系数在整个试验期间，差异显著( P＜0.05) 。
2.2 PFOS 暴露对大鼠肝组织形态学的影响
如图 1 所示，大鼠大体解剖可见 0 mg·kg-1组大鼠肝脏色泽正常， 表面光滑无结节，质地柔软，HE染色显示肝索排列规整，细胞核分布正常，胞质均匀。油红染色少见脂滴沉着。但 PFOS 暴露组大鼠肝脏质地较脆，颜色暗沉，边缘钝化且肝表面分布大小不同的黄色斑点。HE 染色和油红染色结果显示PFOS 组肝细胞出现不同程度肿胀和核的偏移，镜下可见细胞空泡和大小不等的脂滴出现，细胞内可见红色深染脂肪滴，10 mg·kg-1组改变最明显。
2.3 PFOS 暴露对大鼠血清中肝脏代谢酶水平影响
如表 4 所示，PFOS 暴露造成 ALT、 AST、 ALP 水平显著上升( P＜0.05)， 其中 ALT 和 ALP 水平均随暴露浓度增高显著上升(P＜0.05)，AST水平在PFOS各暴露组中均显著高于0mg·kg-1组(P＜0.05)，但不同剂量组间差异并不显著( P＞0.05) 。
2.4 PFOS 暴露对大鼠匀浆氧化还原能力和脂代谢水平的影响
如表5所示，对各组大鼠肝细胞匀浆中氧化还原酶水平的检测发现， 5 mg·kg-1 PFOS 暴露组大鼠肝脏 SOD 活性相比对照组显著增高， 但随着染毒剂量的增高又出现了显著降低( P＜0.05) 。与 SOD 改变不同的是，GSH-Px活性虽然随着 PFOS 剂量的增加而出现上升，但仅在 10mg·kg-1有显著差异， MDA水平改变与 GSH-Px 趋势类似， 在暴露组中随 PFOS浓度增加 MDA 水平也随之显著升高( P＜0.05)。另外对肝脏匀浆中脂肪水平的检测发现， 与 0 mg·kg-1组相比，10 mg·kg-1 组无论是 TC 还是 TG 水平都出现了显著增高( P＜0.05)，同样的情况也出现在 5 mg·kg-1组，但差异并不显著( P＞0.05) 。
2.5 PFOS 暴露对大鼠肝脏相关基因表达影响
如图2所示，对肝脏中氧化应激相关的调控相关因子 Nrf2 表达水平进行检测发现， PFOS 暴露后大鼠肝脏 Nrf2 水平与 0 mg·kg-1 组相比分别上调了约 1.8和2.4倍， 且随着暴露剂量增加差异更为显著，同时Nrf2 信号相关基因醌 氧化还原酶抗体(Quinone oxidoreductase1，NQO1)和血红素氧合酶1(Hemeoxygenase 1，HO-1)的表达也在暴露后上调2 倍左右，但不同剂量组未见显著差异。同时，脂代谢调控基因脂肪酸转移酶( Cluster of differentiation36， CD36) 和 SREBP1c 的表达也在 10 mg·kg-1出现了显著增高， 尤其 SREBP1c 受 PFOS 影响更为显著，表现出明显的剂量反应关系。
三、讨论( Discussion)
PFOS 作为全氟化合物 ( perfluorocarbons， PFCs) 的代表化合物， 对生殖发育、免疫神经等多器官间接或直接的损伤近年来备受关注， 尤其肝脏作为PFOS 的蓄积器官，关于 PFOS 所诱导的肝脏损伤常有报道，但具体机制尚未完全清楚。本实验中发现PFOS 暴露后大鼠 AST等肝功能酶发生显著改变，提示肝细胞膜结构和功能的损伤， HE 和油红染色病理结果也显示 PFOS 暴露组具有明显的肝脏形态异常，这和其他啮齿类及鱼类等动物模型中得到的结论一致。同时我们还发现，肝脏中TC和TG表5 PFOS 暴露对大鼠肝组织中氧化还原酶和脂代谢的影响( — x±s， n的水平出现了显著的增高，在高剂量组中较为显著，这和 Cui 等研究结果一致，以上现象可能与PFOS 对脂肪代谢途径中调控因子的影响有关。
本次实验中发现PFOS暴露能显著上调SREBP1cmRNA 表达。这与Lv 等在宫内暴露子鼠肝脏中发现的结果一致。SREBP 是位于内质网质膜上一种膜连接蛋白，具有3种亚型，其中SREBP 1c 证明在脂肪合成调节中发挥重要作用，能影响下游乙酰辅酶 A 羧化酶 1( Acetyl-CoA carboxylase1， ACC1) 、 脂肪酸合成酶( Fatty acid synthetase，FAS) 、 硬脂酰辅酶 A 去饱和酶1( Stearyl-CoA desaturase 1， SCD1) 等重要脂代谢酶的表达，改变细胞炎症趋化因子配体2 ( Inflammatory chemokine 2，CCL2) 和成纤维细胞生长因子 21( Fibrolast growthfactor-21， FGF21) 水平，诱导肉毒碱棕榈酰基转移酶( Carnitine palmitoyltransferase 1 A， CPT1A) 的表达改变，并能通过与胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白 ( Sterolregulatory element binding proteinscleavage-activating protein， SCAP) 的作用调控低密度脂蛋白受体( Low-densitylipoprotein receptor， LDLR) 及载脂蛋白 E( Apolipoprotein E， ApoE) 等脂转运相关基因的表达，打破脂蛋白受体( Lipoprotein receptor) 和 HMGCoA 还原酶( HMG-CoA reductase) 的反馈平衡。这可能是造成 PFOS 组动物肝中TG 和 TC 指标上升的原因之一。同时实验中也发现 PFOS 组抗氧化指标和机体抗氧化基因 Nrf2 的改变， 也可能与这种脂代谢紊乱后机体被迫加速脂肪β氧化后产生大量活性氧( reactive oxygen species， ROS) 有关。
Nrf2 是抗氧化酶表达过程中的关键调控因子，对平衡体内氧化-抗氧化系统， 抵抗 ROS 导致的损害起到关键作用。当出现氧化应激、亲电子物质或者化学物质刺激时，Nrf2可借助胞质接头蛋白( Kelch like ECH associatedprotein 1， Keapl) 的构象改变来完成活化转核， 与细胞核内小 Maf 蛋白结合形成二聚体， 借此启动由抗氧化作用元件( Antioxidantresponse element， ARE) 介导的 HO1 和 NQO1等抗氧化反应，参与氧化应激状态下的细胞保护及修复过程。有研究表明，Nrf2 的表达可以引起肝脏脂质积聚。More 等在长期高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中发现， Keap1敲除小鼠的肝脏中出现较野生型小鼠更加严重的脂质沉积。Pi 等在啮齿类动物实验中发现 Nrf2 可以转录调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPAR-γ) 和CCAAT /增强子结合蛋白( CEBP) 以增强脂肪前体细胞分化，从而导致脂质的合成增加。最近也有研究发现，在双酚 A( BPA) 暴露的小鼠肝脏中， Nrf2 和 SREBP1c共同参与了肝脏脂质的沉积， 同时在 Nrf2 转染和萝卜硫素( Nrf2 激动剂) 处理肝细胞中发现， SREBP1c的表达会显著增加。以往研究中发现 PFOS 能够诱导细胞氧化应激出现，同时上调 Nrf2 及下游基因的表达。因此， 我们推测 PFOS 导致的大鼠肝脏脂质沉积可能与 Nrf2 的激活有关。
同时也有研究表明， Nrf2 入核后通过与下游反应原件的结合，能够以不依赖过氧化物酶体增殖物激活受体( Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR) 的方式上调 CD36 表达［29］ 。本次结果中也发现 PFOS 暴露组 CD36 受到显著影响。CD36 属于B 类清道夫受体家族， 能识别包括氧化低密度脂蛋白( Low density lipoprotein， LDL) 、 长链脂肪酸( Longchain fatty acid， LCFA) 、 非修饰脂蛋白和淀粉样蛋白等在内的内源性配体，可由 ROS 激活其 3 个外显子的转录活性，参与由代谢过剩所触发的多器官慢性低丰度性炎症反应［ 30］ 。CD36 可通过过氧化物酶MPO-H2O2-NO2系统，与 Toll 样受体( Toll-like receptor， TLR) TLR4 和 TLR6 结合成异三聚体，进入细胞膜和脂阀后募集形成 CD36 /Lyn /TLRs 多聚体， 影响脂质的摄取和转运。
小鼠实验发现 CD36 表达改变能影响心肌、 骨骼肌、 脂肪等多个组织部位的脂肪储留，而不同药物或 RNA 干扰动物中上调或降低肝脏 CD36 表达可造成实验动物出现脂毒性及脂肪转运能力的改变 。同时 CD36 能调控前炎症相关信号通路如核转录因子-KB( Nuclear factorkappaB， NF-KB) 、 核转录抑制因子(Inhibitory factor kappaB， iKB) 和细胞外调节蛋白激酶 1 /2 ( Extracellularregulated protein kinases 1 /2， ERK1 /2) 的活化，调节粘附分子、 趋化因子、 炎症因子、 一氧化氮合成酶(NOS) 等分子表达改变， 激活肝星状细胞诱发自身免疫，导致线粒体解偶联蛋白( Uncouplingprotein，UCP) 及脂肪酸合成酶 Fas 配体诱导活化，形成“二次打击” 使肝脏损害呈现恶性循环。
综上所述，PFOS具有明显的肝毒性作用，可导致肝脏形态异常并影响肝脂代谢水平，这可能与PFOS 引起的氧化应激所导致的损伤有关。
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本文主要内容来来自于：张宵月， 肖静* ， 徐苗苗，彭美娟， 朱晓凡， 高尚， 张桃娜
南通大学公共卫生学院 职业卫生与环境毒理学教研室，南通226019
氧化应激文章编号: 1673－5897( 2018) 6－226－08
中图分类号: X171.5 文献标识码: A
DOI: 10.7524 /AJE.1673－5897.20180316001版权归属于原作者。
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